Nanoporiën maken massaspectrometer voor eiwitten mogelijk

Onderzoekers van de Rijksuniversiteit Groningen hebben nanoporiën ontwikkeld waarmee ze direct de massa van kleine eiwitjes (peptiden) kunnen meten. Hoewel de gevoeligheid nog beter moet, bewijzen hun experimenten dat het mogelijk is een goedkope, draagbare massaspectrometer te bouwen op basis van bestaande nanoporie-technologie en de nieuwe, gepatenteerde nanoporiën die zijn ontwikkeld in het lab van adjunct-hoogleraar Chemische Biologie prof. dr. Giovanni Maglia. Een artikel over deze ontdekking is op 19 februari 2019 gepubliceerd in het wetenschappelijke tijdschrift Nature Communications.

Massaspectrometers zijn cruciaal voor onderzoek naar eiwitten. Maar het zijn grote, dure apparaten waardoor ze alleen in gespecialiseerde laboratoria te vinden zijn. ‘En dat terwijl de volgende revolutie in biomedisch onderzoek zal liggen in de proteomics, de grootschalige analyse van de eiwitten die verschillende celtypen produceren’, zegt Maglia. Hoewel alle cellen in ons lichaam hetzelfde DNA bevatten, verschilt de productie van eiwitten sterk tussen verschillende celtypen. ‘Daarnaast worden eiwitten vaak nog aangepast nadat ze door de cel zijn gemaakt, bijvoorbeeld doordat er suikerketens aan worden gekoppeld die hun functie beïnvloeden.’

Nanoporie-technologie biedt de mogelijkheid om afzonderlijke moleculen te analyseren. In eerder werk liet Maglia al zien dat nanoporiën te gebruiken zijn om stofwisselingsproducten te meten en om eiwitten en peptiden te identificeren. Deze poriën zijn grote eiwitstructuren die in een membraan zitten. Moleculen die in zo’n porie terechtkomen of er doorheen gaan, kunnen een elektrische stroom die door de porie loopt beïnvloeden. ‘Een probleem bij het meten van de massa van peptiden is dat ze te snel door de porie heen gaan om ze zo te analyseren, zelfs in de kleinste beschikbare poriën’, legt de chemisch bioloog van de Faculty of Science and Engineering uit.

Kleinste porie ooit

Het was een hele uitdaging om nog kleinere poriën te maken. ‘Poriën zijn opgebouwd uit een aantal bouwstenen, de monomeren. In eerste instantie veranderden we de interacties tussen die monomeren, maar dat werkte niet.’ Wel zagen de onderzoekers dat wanneer ze monomeren mengden met extra veel lipiden (die de membranen vormen) er meer kleine poriën verschenen. Dat bracht hen ertoe om de interactie van de monomeren met lipiden aan te passen. Dit leverde poriën op die bestonden uit minder monomeren, en dus kleiner waren.

Maglia kan nu kleinere, trechtervormige poriën maken waarvan de uiteinden tot slechts 0,84 nanometer meten. ‘Dit zijn de kleinste biologische poriën die ooit gemaakt zijn.’ De volgende uitdaging was om er voor te zorgen dat peptiden door de porie heen gaan, wat hun chemische samenstelling ook is. ‘De poriën zijn negatief geladen, wat belangrijk is voor hun werking’, legt Maglia uit.

De lading zorgt ervoor dat water door de porie stroomt en daarbij de peptiden meeneemt. Maar die lading stoot negatief geladen peptiden af aan het dunne uiteinde van de trechter. Maglia paste de lading aan door de zuurgraad te veranderen. ‘Uiteindelijk lukte het om de juiste condities te vinden. Bij een zuurgraad van exact pH 3,8 konden de negatief geladen peptiden door de porie heen, terwijl er nog voldoende water doorheen stroomde.’

Gevoeligheid

Metingen met behulp van nanoporiën van verschillende diameters lieten zien dat de elektrische stroom door de porie recht evenredig verandert met het volume van de peptiden die er doorheen gaan. Deze peptiden waren vier tot 22 aminozuren lang. Daarbij was het verschil in massa tussen de aminozuren alanine en glutamaat meetbaar, wat betekent dat de gevoeligheid ligt rond de 40 Dalton (een maat voor de massa van eiwitten). ‘De gevoeligheid van gewone massaspectrometers is veel beter, maar als we het systeem nog veertig keer gevoeliger kunnen maken zou het al bruikbaar zijn voor proteomics onderzoek’, zegt Maglia. En er zijn allerlei manieren om dat te bereiken: ‘We kunnen nanoporiën maken met kunstmatige aminozuren, andere vloeistoffen gebruiken in de experimenten, de ruis verminderen door bij lagere temperaturen te meten, enzovoorts.’

Het nanoporie systeem heeft daarbij een aantal voordelen: het meet afzonderlijke moleculen, de technologie zelf is al commercieel verkrijgbaar en relatief goedkoop. Bovendien is een nanoporie systeem draagbaar. En door verschillende poriën in één systeem te combineren is het mogelijk tegelijkertijd eiwitten van verschillende groottes te meten. ‘Alles bij elkaar laat dit zien dat een veelzijdige en goedkope massaspectrometer voor de analyse van peptiden haalbaar is’, zegt Maglia. ‘En daarmee zouden veel meer laboratoria zo’n apparaat kunnen aanschaffen om die belangrijke proteomics studies naar eiwitten in cellen te doen.’

Referentie: Gang Huang, Arnout Voet, Giovanni Maglia: FraC nanopores with adjustable diameter identify the mass of opposite-charge peptides with 44 dalton resolution. Nature Communications 19 February 2019.