De resolutie-revolutie nu ook in Groningen

Toen Cristina Paulino bijna tien jaar geleden ging werken met een cryo elektronenmicroscoop verwachtte niemand dat deze techniek een revolutie in de wetenschap zou veroorzaken. Dit jaar ging de Nobelprijs voor chemie naar deze vorm van onderzoek. En Paulino heeft de techniek nu naar de RUG gebracht.

Ze heeft net een artikel gepubliceerd in het toptijdschrift Nature, over werk dat ze heeft gedaan tijdens haar vorige aanstelling in Zürich. ‘De afgelopen drie jaar zijn er in tijdschriften als Nature, Science of Cell meer dan tweehonderd artikelen gepubliceerd gebaseerd op cryo elektronenmicroscopie.’ Dat is het gevolg van de ‘resolutie revolutie’, veroorzaakt door een snelle verbetering van de technologie van elektronenmicroscopen en de bijbehorende software, die het mogelijk maakt om de structuur van complexe eiwitten op atomair niveau in beeld te brengen.

Alles wat je nodig hebt om aan die revolutie mee te doen is een microscoop van 3 tot 6 miljoen euro, een onderhoudscontract van zo’n 200.000 euro, nog eens een ton voor een krachtig computercluster voor beeldverwerking en enkele zeer ervaren mensen om het systeem te bedienen. ‘Het is momenteel een enorm probleem om de juiste mensen te vinden om de machine te bedienen’, zegt Paulino. Zelf zit zij een belangrijk deel van haar tijd achter de microscoop. ‘Er is nu eenmaal ervaring nodig om dit werk goed te doen’, legt zij uit.

Resultaten

Vier jaar geleden konden maar een paar grote nationale laboratoria zich een goede cryo elektronenmicroscoop veroorloven, labs die hun geld kregen van bijvoorbeeld de Amerikaanse National Institutes of Health of een Duits Max Planck instituut. Maar de microscopen zijn inmiddels eenvoudiger te bedienen en goedkoper, zodat steeds meer labs ze aanschaffen – en dus ervaren personeel nodig hebben. In Nederland staan twee zeer goede cryo elektronenmicroscopen, geschikt voor biologisch onderzoek, bij de NeCEN faciliteit in Leiden. Andere modellen zijn recent afgeleverd in Utrecht, Delft en Maastricht. Met de komst van Paulino is er ook een aangeschaft in Groningen, het apparaat is sinds juni in gebruik en produceert inmiddels al de eerste resultaten.

Als PI (hoofdonderzoeker) is Paulino verantwoordelijk voor de microscoop. Maar ze benadrukt dat zij geen ‘microscopist’ is: ‘Ik ben een biochemicus met belangstelling voor membraaneiwitten, vooral in de relatie tussen structuur en biologische functie. Dus wil ik weten hoe die eiwitten eruit zien.’ Ze is opgeleid in alle biochemische technieken. In 2008 begon ze een promotieonderzoek in het lab van Werner Kühlbrandt, een van de pioniers in cryo elektronenmicroscopie. ‘Destijds dacht niemand dat dit vakgebied zo groot zou worden.’

Foutloos

Om een eiwitstructuur op atomaire schaal zichtbaar te maken moet iedere stap in het proces foutloos zijn. Allereerst wordt een monster zeer snel bevroren, door het onder te dompelen in vloeibaar ethaan dat is gekoeld met vloeibaar stikstof (met een temperatuur van -180 graden). ‘Het eiwit dat je gaat onderzoeken zit op een drager in een dun laagje water. Het bevriezen gaat zo snel dat er geen ijskristallen ontstaan, die de structuur kapot kunnen maken.’

Na deze ‘vitrificatie’ gaat de drager op een monsterhouder in de microscoop. ‘Daarbij moet je geen trillende handen hebben, dan kan je het apparaat beschadigen. In sommige labs mogen alleen een of twee specialisten deze stap uitvoeren.’ Het uitlijnen en het programmeren van de microscoop om het monster in het juiste patroon te scannen kan gemakkelijk een dag kosten, minder dan vroeger. ‘Dit is een recente doorbraak, de software voor het apparaat is namelijk veel gebruiksvriendelijker geworden.’ Het verzamelen van de gegevens verloopt vervolgens volledig automatisch.

Pensioen

Tijdens de voorbereidingen moeten alle delen van de microscoop perfect uitgelijnd worden. Dat is een klus die je niet kunt leren in een cursus van een paar weken. ‘Je hebt er jaren ervaring voor nodig, waarin je allerlei problemen een keer bent tegengekomen.’ En als gezegd, mensen met jaren ervaring zijn er niet zo veel. Op dit moment krijgt Paulino assitentie van Gert Oostergetel. ‘Hij is eigenlijk al twee jaar met pensioen, maar bleef nog wat langer om mij te helpen. Hij heeft een enorme ervaring met elektronenmicroscopie.’

De microscoop scant een paar duizend tot wel een miljoen eiwitten in het monster. De volgende stap is om alle beelden samen te voegen tot een volledige structuur. ‘Op een goede dag kun je zomaar vier terabyte aan gegevens verzamelen, die je moet analyseren. Alleen sterrenkundigen hebben een vergelijkbare hoeveelheid data om te verwerken, op te slaan en te analyseren.’ Paulino heeft al zo’n 100.000 euro uitgegeven aan rekenkracht. ‘En ik heb nog meer nodig. Ik ben de afgelopen jaren een echte computerexpert geworden.’

Voorrecht

Momenteel zit Paulino een flink deel van haar tijd achter de microscoop. ‘Maar ik ben nu voor het eerst leider van een onderzoeksgroep en dat kost ook veel tijd.’ Daarom hoopt zij snel een goede medewerker te vinden die de microscoop kan bedienen. Niet dat ze klaagt, benadrukt ze: ‘Het is een enorm voorrecht om zoveel toegang te hebben op een microscoop van deze kwaliteit, die een oplossend vermogen heeft tot 3 Ångström. Voor de meeste wetenschappers is het een groot probleem om onderzoektijd te krijgen op zo’n apparaat en ik krijg net zoveel tijd als ik wil.’

Op 13 december publiceerde zij een artikel in Nature, over onderzoek dat zij deed tijdens haar vorige aanstelling, in Zürich. Het beschrijft de structuur van een eiwit dat lijkt op een zogeheten scramblase, een eiwit dat in de celmembraan zit en de bouwstenen van die membraan, de fosfolipiden, heen en weer kan laten springen tussen de binnenste en de buitenste membraanlaag. Maar Paulino ontdekte dat het eiwit werkt als een kanaal voor transport van ionen, met twee poriën die openen in de aanwezigheid van calcium.

Concurrentie

‘De grote vraag was: hoe kan een scramblase zich nu gedragen als een kanaal? Met onze hoge-resolutie structuur konden we hier een antwoord op geven.’ Een bindingsplaats voor calcium in de holte van het eiwitdeel dat zich in de membraan bevindt bleek te kunnen zorgen voor een structuurverandering die de porie opent.

Het is een voorbeeld van de resultaten die zijn te bereiden dankzij de atomaire resolutie van eiwitten. In de paar maanden dat ze nu in Groningen werkt is ze al bezig met het oplossen van de structuur van verschillende eiwitten, in samenwerking met collega’s van de RUG en uit Duitsland en Zwitserland. ‘Ik kan je helaas niet precies vertellen wat ik doe, de concurrentie in dit veld is moordend.’ Maar ze belooft wel enkele belangrijke publicaties in het nieuwe jaar.

Zie ook:
Op zoek naar de basis van het leven
Nobelprize Chemistry 2017

Referentie:
Cristina Paulino, Valeria Kalienkova, Andy K. M. Lam, Yvonne Neldner & Raimund Dutzler: Activation mechanism of the calcium-activated chloride channel TMEM16A revealed by cryo-EM. Nature, 13 December, DOI 10.1038/nature24652