Klein enzym krijgt nieuwe functie

Gerrit Poelarends was op zoek naar een enzym om een belangrijke stap in de productie van geneesmiddelen groener en efficiënter te maken. Die speurtocht bracht hem bij een klein eiwit met de naam 4-oxalocrotonaat tautomerase. Het kostte hem vijf jaar om de mogelijkheden van dit enzym in kaart te brengen en het flink te verbouwen zodat het de gewenste stap efficiënt kon uitvoeren. De resultaten zijn op 8 maart verschenen in het tijdschrift Nature Communications.

Er bestaat een klasse geneesmiddelen die ongewenste hersenactiviteit remmen, gebaseerd op de verbinding gamma-aminoboterzuur (GABA). Varianten hiervan worden bijvoorbeeld gebruikt als middel tegen epilepsie, of tegen neurologische pijn. Voor het maken van GABA varianten is het nodig om de koolstofatomen van twee bouwstenen aan elkaar te koppelen. Dat is een ingewikkelde stap waar nogal onaangename organisch chemische stoffen bij nodig zijn. ‘Dus vroeg ik mij af: zou er geen enzym zijn dat deze koppeling kan verzorgen?’ vertelt Gerrit Poelarends, adjunct hoogleraar Farmaceutische Biotechnologie aan de RUG.

Het korte antwoord was ‘nee’. Maar de katalysator die gebruikt werd voor de reactie, die plaatsvindt in giftige organische oplosmiddelen, is een afgeleide van het aminozuur proline. ‘Dus het leek aannemelijk dat een enzym met zo’n proline in het reactieve centrum, het deel van het enzym waar de reactie plaatsvindt, misschien wel deze koppeling kan uitvoeren.’

En het toeval wil dat Poelarends al een tijdje werkte met precies zo’n enzym, dat de naam 4-oxalocrotonaat tautomerase draagt. Het is een heel klein enzym dat bestaat uit slechts 62 aminozuren, waar een gemiddeld enzym al snel is opgebouwd uit een paar honderd aminozuren. ‘We testten dit enzym en het bleek inderdaad de cruciale stap in de productie van GABA uit te voeren.’ Er waren slechts twee problemen: de reactie ging nogal traag en leverde het verkeerde eindproduct op.

Dat had het einde van een mooi idee kunnen zijn, maar voor Poelarends en zijn promovendus Jan-Ytzen van der Meer was dit het begin van een zeer productief onderzoeksproject. ‘We wilden kijken of we het enzym konden ombouwen zodat het ging doen wat wij wilden.’ Omdat het een klein enzym is, was het mogelijk om dit systematisch aan te pakken: ‘In de natuur komen twintig verschillende aminozuren voor als bouwstenen van eiwitten. Dus we besloten elk van de 61 aminozuren van het tautomerase te vervangen door vijftien tot negentien andere aminozuren.’ Het eerste aminozuur, de cruciale proline in het reactieve centrum, moest natuurlijk intact blijven.

Een commercieel bedrijf produceerde meer dan duizend mutanten van het tautomerase gen die vervolgens in cellen werden ingebracht. De veranderde enzymen die hierdoor ontstonden zijn stuk voor stuk getest op de gewenste activiteit. ‘Dit leverde een soort kaart op die op een aantal plaatsen hot spots liet zien, waar een verandering van een aminozuur zorgt voor een grotere activiteit.’ Door vervolgens mutaties van verschillende hot spots te combineren kon die activiteit verder worden vergroot.

Maar toen was er nog het probleem dat de reactie het verkeerde eindproduct opleverde. ‘De reactie kan twee varianten opleveren die elkaars spiegelbeeld zijn’, legt Poelarends uit. Die twee zogeheten ‘enantiomeren’ verschillen van elkaar zoals een linker hand van een rechter hand verschilt. Dat is nogal belangrijk, want bij geneesmiddelen is doorgaans maar een van beide ‘handen’ werkzaam. Dus testten zij hun mutanten op enantioselectiviteit, het vermogen om vooral de juist hand te maken. Dat leverde opnieuw een kaart met hot spots op.

Het resultaat van al dit werk is op 8 maart gepubliceerd in het tijdschrift Nature Communications. ‘Wat wij daar laten zien is de eerste stap – we moeten het resultaat nog verder verbeteren voordat het enzym interessant kan zijn voor de farmaceutische industrie’, zegt Poelarends. Zijn groep heeft ook de 3D structuur van het enzym al ontrafeld, wat hem een goed idee geeft waar hij verdere veranderingen zou moeten doorvoeren via ‘rationeel eiwit ontwerp’.

Maar het resultaat tot nu toe is al indrukwekkend. De activiteit is met een factor 20 toegenomen en de juiste enantiomeer vormt inmiddels 90 procent van de opbrengst. ‘Vijf jaar geleden was er geen enzym bekend dat deze stap in de productie van GABA varianten kon katalyseren. Wij vonden een enzym met een zeer lage activiteit en het verkeerde eindproduct en hebben het omgevormd tot iets dat werkt.’

Het afgelopen jaar heeft Poelarends drie nieuwe onderzoekbeurzen binnengehaald om het project verder te ontwikkelen. Die kwamen van de EU, van de Nederlandse onderzoekfinancier NWO en van de Europese tegenhanger ERC, die een ‘proof of concept’ beurs toekende. Alles bij elkaar heeft hij ruim een miljoen euro binnengehaald voor zijn onderzoek. Het eindproduct waar hij naar toe wil is een cel waar je gewone voedingsstoffen in stopt en die dan de nuttige GABA verbindingen produceert. Zo’n biologisch systeem zou de vervuilende en energie vretende chemische synthese moeten vervangen.

‘En dit enzym heeft meer mogelijkheden’, denkt Poelarends. Het tautomerase is een ‘promiscue’ enzym, wat betekent dat het veel verschillende reacties kan uitvoeren, al is het dan met een lage activiteit. Met behulp van zijn set mutanten kan Poelarends relatief eenvoudig nieuwe activiteitenkaarten maken die hem zullen helpen het enzym aan te passen voor andere doeleinden, zoals bijvoorbeeld de synthese van aminozuren voor nieuwe peptide antibiotica. ‘Het is een fantastisch systeem. Onze investering van de afgelopen jaren begint zich nu echt terug te betalen.’

Referentie: Jan-Ytzen van der Meer, Harshwardhan Poddar, Bert-Jan Baas, Yufeng Miao, Mehran Rahimi, Andreas Kunzendorf, Ronald van Merkerk, Pieter G. Tepper, Edzard M. Geertsema, Andy-Mark W.H. Thunnissen, Wim J. Quax and Gerrit J. Poelarends Using mutability landscapes of a promiscuous tautomerase to guide the engineering of enantioselective Michaelases, Nature Communications, 8 March, DOI 10.1038/NCOMMS10911.