Nanoporie kan moleculen herkennen en eiwitten ontrafelen

Eiwitten zijn van levensbelang. Omdat verschillende weefsels in ons lichaam vaak verschillende eiwitten produceren in verschillende hoeveelheden, soms met speciale aanpassingen, is het belangrijk om één enkel eiwit in detail te kunnen bestuderen. RUG-wetenschappers hebben kort achter elkaar twee artikelen gepubliceerd, in Nature Communications en Nature Chemistry, waarin ze beschrijven hoe een construct van een eiwitcomplex bovenop een nanoporie is te gebruiken om de ‘vingerafdruk’ van een enkel eiwit te herkennen. De verwachting is dat dit systeem op termijn ook de volledige eiwitsamenstelling zal kunnen ontrafelen.

Het in kaart brengen van iemands complete DNA kan tegenwoordig snel en goedkoop. Maar hoewel de eiwitten in ons lichaam gemaakt worden op basis van dit DNA weten we daar relatief weinig van. ‘DNA is een statisch molecuul’, legt Giovanni Maglia uit. Hij is hoogleraar chemische biologie aan het Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute van de RUG. De eiwitten die op basis van de DNA-code worden gemaakt zijn veel dynamischer. Hun concentratie kan verschillen per weefseltype of zelfs per celtype, van eiwitten kunnen allerlei varianten bestaan die soms na hun productie nog weer worden aangepast.

Reactievat

De gouden standaard voor eiwit-analyse is massaspectrometrie. ‘Alleen heb je daarvoor een bepaalde hoeveelheid eiwit nodig, het is niet geschikt om één enkel eiwit mee te analyseren. Bovendien kun je met massaspectrometrie alleen de samenstelling meten van peptiden, kleine eiwitfragmenten, waardoor je informatie over de heterogeniteit van een eiwit verliest’, zegt Maglia. Hij heeft zelf ruime ervaring in het bestuderen van eiwitten met behulp van nanoporiën. ‘Dit is een veelbelovende techniek om één enkel en compleet eiwit te bestuderen, wat nieuwe inzichten zal opleveren. We denken hierbij aan twee technieken: het eiwit in kleine stukjes hakken om een ‘eiwit-vingerafdruk’ te maken, of de aminozuurvolgorde van het hele eiwit te meten, het “sequencen” van dat eiwit.’

In twee artikelen, de eerste in Nature Communications op 4 oktober, de tweede in Nature Chemistry op 18 november, beschrijft Maglia met zijn collega’s hoe een nanoporie een eiwit kan herkennen aan het signaal van de peptiden en hoe een nanoporie voorzien kan worden van een piepklein reactievat in de vorm van een proteasoom (een eiwitcomplex dat eiwitten afbreekt). Dit proteasoom kan een eiwit in kleine stukjes hakken die dan vervolgens in de porie zijn te identificeren. In de toekomst kan dit systeem ook gebruikt worden om een enkel intact eiwit door de porie te laten gaan, waarbij de aminozuren waaruit het is opgebouwd één voor één worden geïdentificeerd.

Vingerafdruk

De publicatie in Nature Communications laat zien hoe het mogelijk is om het eiwit te identificeren door de vingerafdruk van de afgeknipte peptiden in de nanoporie te meten. ‘We gebruikten het enzym trypsine om kleine fragmentjes te knippen, en een lage zuurgraad om ze te kunnen detecteren.’ In het Nature Chemistry artikel beschrijven de onderzoekers hoe zij het proteasoom-nanoporie construct hebben geconstrueerd. ‘Het proteasoom is een ingewikkeld systeem dat bestaat uit 42 verschillende onderdelen’, legt Maglia uit. Het bevat structuren die eiwitten vangen, uitvouwen en opknippen in peptiden die vervolgens door de porie gaan. ‘Het volume van de peptiden zorgt voor een specifieke verstoring van een elektrische stroompje door de porie, dat signaal stelt ons in staat om een soort vingerafdruk te maken waaraan we het eiwit kunnen herkennen.’

Competitie

De kracht van de nanoporie-methode is dat hiermee individuele eiwitmoleculen zijn te identificeren. Het proteasoom vormt het reactievat dat een eiwit voorbereidt op identificatie. ‘Ons systeem werkt, maar we moeten het nog verbeteren’, zegt Maglia. De peptiden gaan nu nog te snel door de porie om ze te kunnen identificeren of sequencen. ‘Om de aminozuurvolgorde af te kunnen lezen moeten we een vernauwing van minder dan een nanometer aanbrengen in de porie.’ Dan is het mogelijk om langere stukken van het eiwit in de nanoporie af te lezen. ‘Wanneer we de techniek gebruiken om het eiwit eerst in stukjes te hakken, zullen we iets als trypsine aan het proteosoom moeten toevoegen, en zorgen dat de nanoporie de fragmenten netjes opvangt.’

Er vindt momenteel veel onderzoek plaats om dit soort sequencing van eiwitmoleculen mogelijk te maken, de competitie is groot. Naast de twee publicaties uit de groep van Maglia hebben twee andere onderzoeksgroepen (een uit China, de ander ook uit Nederland) hun aanpak gepubliceerd. Zij koppelden kleine DNA-moleculen aan de eiwitfragmenten die dan met een speciaal enzym (helicase) door de nanoporie werden getrokken. ‘Het is moeilijke te zeggen welke aanpak de beste zal blijken te zijn’, zegt Maglia. ‘Hun techniek verplaatst de eiwitfragmenten erg nauwkeurig door de porie, onze techniek heeft als voordeel dat het hele eiwit er doorheen gaat, zonder koppeling aan DNA.’

Referenties:
Florian Lucas, Roderick Versloot, Liubov Yakovlieva, Marthe T. C. Walvoort & Giovanni Maglia: Protein identification by nanopore peptide profiling. Nature Communications 4 October 2021

Shengli Zhang, Gang Huang, Roderick Versloot, Bart Marlon Herwig Bruininks, Paulo Cesar Telles de Souza, Siewert-Jan Marrink, and Giovanni Maglia: Bottom-up fabrication of a proteasome–nanopore that unravels and processes single proteins. Nature Chemistry, 18 November 2021