Dubbele rem op transporteiwit voorkomt dat cellen ontploffen

Kort & bondig

Bacteriecellen krimpen en stoppen met groeien wanneer de concentratie opgeloste stoffen in de omgeving hoog is. Daarom zijn zout en suiker goede conserveringsmiddelen. Maar sommige bacteriën kunnen moleculen opnemen waarmee ze hun concentratie opgeloste stoffen verhogen, en ze toch kunnen groeien in de aanwezigheid van zout of suiker. Het transporteiwit OpuA importeert daarvoor de stof glycine betaïne. Samen met zijn collega Cristina Paulino heeft RUG-hoogleraar biochemie Bert Poolman de structuur van het OpuA eiwit opgehelderd. Dankzij deze kennis begrijpen we hoe het eiwit werkt en hoe dit is te blokkeren zodat bacteriën weer gevoelig worden voor conserveringsmiddelen. Daarnaast wil Poolman het gebruiken bij een ander project: samen met een aantal collega’s probeert hij een kunstmatige cel te bouwen. OpuA moet er voor zorgen dat de druk in die cel niet te hoog en niet te laag is.

Een hoge concentratie zout of suiker in de omgeving zal micro-organismen doen uitdrogen, waardoor ze stoppen met groeien. Om dit tegen te gaan kunnen deze cellen hun concentratie opgeloste stoffen (de osmolariteit) verhogen. RUG-wetenschappers hebben de structuur opgehelderd van het transporteiwit dat glycine betaïne de cel in brengt om osmotische stress tegen te gaan. Het eiwit hoort bij de bekende familie van ABC-transporters, maar blijkt uniek in structuur en werkingsmechanisme. De resultaten van het onderzoek zijn op 18 november gepubliceerd in Science Advances.

Conserveringsmiddelen in voedsel maken het leven voor micro-organismen moeilijk. Zout en suiker zijn bekende voorbeelden: ze zorgen dat de concentratie opgeloste stoffen in het voedsel hoger is dan in de bacterie. Dat trekt water uit de bacterie totdat de concentraties gelijk zijn. Het resultaat is een opgedroogde cel die niet meer kan groeien.

ABC-transporter

‘Alleen hebben sommige bacteriën een verdediging tegen die conserveringsmiddelen ontwikkeld’, zegt Bert Poolman, hoogleraar biochemie aan de RUG. Zo’n twintig jaar geleden vroeg een voedingsmiddelenbedrijf hem iets te vinden dat die verdediging kan doorbreken. Dit leidde tot de ontdekking van OpuA, een transporteiwit dat geactiveerd wordt door uitdroging. Het gaat dan een stof met de naam glycine betaïne naar binnen halen. ‘Die verhoogt de osmolariteit in de cel zonder dat het de structuur van eiwitten aantast. Het resultaat is dat de cellen weer water opnemen en kunnen gaan groeien’, legt Poolman uit.

OpuA hoort bij een bekende klasse eiwitten, de ABC-transporters, een van de grootste eiwitfamilies die we kennen. Mensen hebben ongeveer vijftig verschillende transporteiwitten uit deze familie, sommige planten hebben er honderden, bacteriën zitten daar ergens tussenin. OpuA is bijzonder omdat het grote hoeveelheden glycine betaïne kan importeren, wat leidt tot een zeer hoge concentratie. Daarom wilde Poolman graag weten hoe dit eiwit werkt. ‘Na de ontdekking heb ik daar, met tussenpozen, altijd aan gewerkt.’

Doorbraak

Het grootste probleem was het ophelderen van de eiwitstructuur. Tot voor kort bestond de standaardmethode eruit dat je kristallen van eiwit liet groeien, die dan met röntgendiffractie werden onderzocht. Maar het is erg lastig kristallen te laten ontstaan uit eiwitten die in de celmembraan zitten. En voor OpuA bleek het zelfs onmogelijk. De wetenschappers hebben wel een model van de structuur gemaakt op basis van de aminozuurvolgorde en de bekende structuren van andere ABC trasporters, maar het resultaat kon de werking van OpuA niet verklaren.

De doorbraak kwam dankzij de ontwikkeling van zogeheten cryo-elektronenmicroscopie, en de inzet van promovendus Hendrik Sikkema samen met de onderzoeksgroep van prof. Cristina Paulino van de Cryo-EM groep van de RUG. Een groot aantal individuele OpuA eiwitten is bij zeer lage temperatuur gescand in de elektronenmicroscoop, waarna de beelden zijn samengevoegd om de structuur zichtbaar te maken. Dat leverde niet één, maar vijf verschillende structuren op. ‘Het eiwit is zeer dynamisch, het verandert van structuur tijdens het transportproces en bovendien trillen de verschillende onderdelen ook nog eens spontaan’, legt Poolman uit. ‘Dit ene eiwit bestaat dus in allerlei structuur-varianten. En het is logisch dat je er met zoveel diversiteit geen kristal van kunt laten groeien.’

Prachtig

De eerste conclusie uit het cryo-EM onderzoek was dat bijna alles wat de onderzoekers dachten te weten over de structuur van OpuA niet klopt. ‘Delen waarvan we dachten dat ze aan de binnenkant van de celmembraan hoorden zaten bijvoorbeeld aan de buitenkant’, vertelt Poolman, die de echte structuur ‘prachtig’ noemt. Een tweede conclusie was dat de activiteit van OpuA deels wordt bepaald door cyclisch di-AMP, een secundair boodschappermolecuul dat pas onlangs is geïdentificeerd. ‘Het eiwit reageert primair op de concentratie ionen die varieert met de osmotische stress, maar het gebruikt cyclisch di-AMP als een extra rem om het importeren van glycine betaïne helemaal te stoppen. Dit voorkomt dat de cel explodeert als de osmotische stress is verdwenen.’

Het OpuA eiwit heeft een sensor die de ionenconcentratie meet via een positieve lading, die een interactie aangaat met de negatief geladen celmembraan. Als water uit de cel wordt getrokken neemt de concentratie van zouten toe. ‘Dat verstoort de interactie tussen de sensor en de membraan, wat het pompmechanisme activeert.’ Als de concentratie glycine betaïne hoog genoeg is om de cel tot gewone proporties terug te brengen normaliseert de interactie tussen sensor en membraan. ‘Maar de pomp stopt dan nog niet helemaal, dus er blijft glycine betaïne en dus ook water naar binnen gaan. Dit verhoogt de druk in de cel die daardoor uit elkaar kan barsten.’ Cyclisch di-AMP zet als tweede rem de pomp helemaal uit.

Het artikel in Science Advances beschrijft de verschillende structuren van het eiwit en geeft functionele gegevens over het transporteiwit. Deze combinatie toont aan hoe OpuA precies werkt, een zeer bevredigend resultaat voor Poolman. ‘Hierin komt twintig jaar onderzoek samen, dat al zeven of acht proefschriften heeft opgeleverd.’ De resultaten laten ook zien hoe de resistentie van bacteriën voor conserveringsmiddelen als zout en suiker doorbroken kan worden. ‘Daarnaast maakt mijn groep deel uit van een nationaal consortium dat een synthetische cel wil bouwen. OpuA als regulator van de inwendige druk is een belangrijk onderdeel van ons ontwerp.’

Referentie: Hendrik R. Sikkema, Marco van denNoort, Jan Rheinberger, Marijn de Boer, Sabrina T. Krepel, Gea K. Schuurman-Wolters, Cristina Paulino and Bert Poolman: Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA. Science Advances 18 november