Methode voor grootschalige productie en screening van nieuwe antimicrobiële peptiden

De natuur heeft ons al heel veel antimicrobiële middelen gegeven. Maar gezien de snelle toename van resistentie bij ziekteverwekkers is het nodig om nieuwe, niet-natuurijke antibiotica te maken. En lantibiotica, kleine eiwitten met ringstructuren, zijn een interessante optie. Moleculair biologen van de RUG hebben met collega’s uit Zwitserland en Duitsland een productielijn ontwikkeld om een groot aantal nieuwe lantibiotische peptiden te maken en te testen. Een beschrijving van de methode en de eerste resultaten is gepubliceerd op 1 april in het tijdschrift Nature Chemical biology.

Lantibiotica bestaan uit peptiden (kleine eiwitten) die nadat ze door ribosomen zijn gemaakt nog worden aangepast. Enzymen koppelen verschillende aminozuren in het peptide aan elkaar zodat zich ringen vormen. Een bekend lantibioticum is nisine, een peptide met vijf ringen dat de voedingsindustrie gebruikt als conserveermiddel. ‘De ringen kunnen uit verschillende aminozuurreeksen bestaan’, legt RUG hoogleraar moleculaire biologie Oscar Kuipers uit. ‘We weten bijvoorbeeld dat een selectie van twaalf natuurlijke lantibiotica allemaal een verschillende ring-combinatie hebben.’

Genenbank

Kuipers heeft, samen met collega’s van de ETH Zürich (Zwitserland) en de universiteit van Regensburg (Duitsland) een systeem ontwikkeld om grote aantallen nieuwe lantibiotica te produceren. ‘Eerst maakten we stukjes synthetisch DNA met de code voor verschillende ringen. Die genetische modules combineerden we dan tot lantibioticum-genen met willekeurige combinaties van vijf ringen.’ De genenbank die ze zo maakten bevat ongeveer veertienduizend genen.

De volgende stap was het screenen van de genproducten op werkzaamheid tegen micro-organismen. Hiervoor pasten de onderzoekers een techniek voor het screenen van enzymen aan. Deze is gebaseerd op microbolletjes van alginaat. In deze bolletjes, met een diameter van ongeveer zeventig micrometer kunnen bacteriën groeien. De genen uit de bank zijn in een productie-bacterie gezet, die een rood fluorescerende stof bevat. ‘We verdunden deze bacterie zo ver dat we gemiddeld nul of één cel per bolletje zouden krijgen. En we deden er ook een doelwit-bacterie bij die de lantibiotica zou kunnen doden. Hiervan zaten er ongeveer vijftig in een bolletje.’ Deze doelwitcellen bevatten een groen fluorescerende stof, en ze maakten een enzym dat de lantibiotica die de productiecellen uitscheiden activeert.

Vijftigduizend

Wanneer de bolletjes in een kweekstoof werden gezet vormde de productie-bacterie die er in zat een enkele kolonie van cellen die lantibiotica uitscheiden. Deze peptiden konden niet buiten de bolletjes komen. Het aantal groene kolonies binnen elk bolletje was kleiner naar mate het antimicrobiële effect van de lanthipeptiden sterker was. Met behulp van een apparaat dat kleine deeltjes kan scheiden op basis van fluorescentie was het mogelijk zo’n vijftigduizend bolletjes per uur te screenen, en de cellen met weinig groene fluorescentie eruit te pikken.

Maar dat was nog lang niet het eind van al het werk. De volgende stap was om uit de bolletjes met weinig fluorescentie - en dus een sterke antimicrobieel effect - de cellen te isoleren die de lantibiotica produceren. Dit was op zich niet zo moeilijk, maar het karakteriseren van de peptiden die de cellen maakten was dat wel, vooral omdat er in elk bolletje maar heel weinig van gemaakt werd. ‘We moesten de cellen eerst in grotere hoeveelheden opkweken voordat we genoeg lantibiotica hadden om te analyseren.’ En er was nog een tweede complicatie. Hoewel alle cellen in een bolletje hetzelfde DNA hebben, werken de enzymen die de ringen vormen niet altijd even nauwkeurig. ‘Zelfs in een enkele kolonie van cellen met identiek DNA kunnen zo vijf of zes verschillende lanthipeptiden worden gemaakt.’

Productielijn

Uiteindelijk is een aantal lanthipeptiden met een sterk antibacterieel effect geïsoleerd en gekarakteriseerd. ‘We vonden antibiotica met verschillende werkingsmechanismen, al werkten sommige ervan precies zo als bekende lantibiotica. We bleken zelfs nisine te hebben nagemaakt in onze genenbank.’ Het hele experiment leverde veel informatie op over de relatie tussen structuur en functie van de verschillende ringen in de peptiden. Die informatie is te gebruiken voor een gericht ontwerp van nieuwe antibiotica.

Nog een conclusie uit het onderzoek is dat de ‘productielijn’ – van het maken van een genenbank tot het screenen en karakteriseren van de peptiden – efficiënt werkt. Een volgende stap is om een echte ziekteverwekker als doelwit-bacterie te gebruiken, in plaats van de onschuldige Lactococcus uit de eerste experimenten. ‘En we werken nu aan het maken van lantibiotica met maar één ring. De peptiden met vijf ringen uit de eerste studie zijn te groot voor praktische toepassing in de geneeskunde. Veel antibiotica die we kennen lijken al op een structuur met één ring, zoals bijvoorbeeld vancomycine.’ Deze bestaande antibiotica worden gemaakt door aminozuren met behulp van enzymen aan elkaar te koppelen, terwijl lantibiotica via genen door ribosomen worden gemaakt. ‘Daardoor kunnen we snelle moleculairbiologische technieken gebruiken om grote genenbanken te maken en te screenen.’

Referentie: Steven Schmitt, Manuel Montalbán-López, David Peterhoff, Jingjing Deng, Ralf Wagner, Martin Held, Oscar P. Kuipers & Sven Panke: Analysis of modular bioengineered antimicrobial lanthipeptides at nanoliter scale. Nature Chemical Biology 1 April 2019.