Dubbelpublicatie verklaart hoe één eiwit zowel vetten als zouten verplaatst

Bij hun ontdekking leek de TMEM16 familie van membraaneiwitten te bestaan uit door calcium gereguleerde chloridekanalen. Maar toen bleek dat veel eiwitten uit deze familie scramblases waren, eiwitten die lipiden heen en weer schuiven tussen de twee kanten van een lipide membraan. Soms ging dat gepaard met een niet selectieve verplaatsing van ionen. In een nieuw onderzoek naar TMEM16 eiwitten van zoogdieren en schimmels heeft Cristina Paulino, hoofd van de afdeling cryo-EM aan de RUG, samen met collega’s uitgezocht wat de structuur van de eiwitten zegt over hun functie. De resultaten zijn in twee artikelen gepubliceerd door het tijdschrift eLife op 12 maart.

In de jaren 1980 ontdekten wetenschappers chloride kanaaltjes in cellen, die werden geactiveerd door calcium. Maar pas in 2008 vonden ze de moleculaire identiteit van de kanaaltjes: ze hoorden bij de zogeheten TMEM16 familie. ‘Deze kanaaltjes leken bruikbaar bij de behandeling van de taaislijmziekte, waarbij het chloridetransport in de longen en andere organen niet goed werkt’, vertelt Paulino. Uiteindelijk zijn tien verschillende TMEM16 genen gevonden bij mensen. Maar onderzoek naar hun functie leverde verrassende resultaten op. ‘Twee van de genen zorgden inderdaad voor de aanmaak van chloridekanaaltjes. Maar de andere codeerden voor scramblases, eiwitten die de fosfolipiden kunnen verplaatsen tussen de twee helften van de lipide dubbellaag die de celmembraan vormt.’

Asymmetrie

De lipide samenstelling van celmembranen is niet symmetrisch: de binnenste en buitenste laag bevatten verschillende soorten fosfolipiden. Door de lipiden van de ene naar de andere kant te verplaatsen kunnen scramblases de asymmetrie verbreken. ‘Dit levert een sterk signaal op’, legt Paulino uit. ‘Als er bijvoorbeeld lipiden aan de buitenkant terechtkomen die eigenlijk binnenin horen te zitten, kan dat de cel tot zelfmoord aanzetten. Of, zoals in het geval van de lipide scramblase TMEM16F, de bloedstolling via bloedplaatjes activeren.’ Het is daarom van groot belang voor de cellen om de activiteit van deze scramblases zeer nauwkeurig te reguleren. Maar wat alles nog complexer maakt is dat de scramblase eiwitten zich ook gedragen als niet-selectieve ionen-kanaaltjes.

Als postdoc in het lab van Raimund Dutzler loste Paulino de structuur op van TMEM16A, een eiwit dat exclusief als kanaal functioneert. Dit deed zij met cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). Samen met de structuur van het verwante schimmeleiwit nhTMEM16, die via röntgendiffractie was opgehelderd, leverde dit meer begrip op over de manier waarop de TMEM16 familie werkt. ‘Beide onderzoeken lieten aspecten zien van de verschillende functies binnen deze familie. We begonnen te begrijpen hoe eiwitten met een vergelijkbare structuur zich in verschillende taken kunnen specialiseren.’ In de structuur van de scramblases zag zij een soort lange gleuf die door de celmembraan heen liep, en waar lipiden doorheen konden schuiven. Die gleuf was afgesloten in de structuur van de chloridekanaaltjes en vormde er een porie waardoor ionen zich door de membraan konden verplaatsen.

Verklaringen

Maar er bleven nog belangrijke vragen open: ‘We wilden graag weten hoe calcium de activiteit van scramblases kan reguleren en hoe sommige van die eiwitten tegelijkertijd ionentransport kunnen faciliteren.’ Om dit uit te zoeken besloot Paulino, die inmiddels een eigen onderzoeksgroep heeft aan de RUG, samen met de groep van Dutzler in Zürich om het eiwit TMEM16F uit zoogdiercellen te bestuderen. Dit speelt een belangrijke rol bij bloedstolling. Ze wisten de structuur van het eiwit te achterhalen, zowel met als zonder calcium. Dat zou een open en gesloten staat moeten opleveren. Maar de open staat, met de groef waarlangs de lipiden en ionen zich door de membraan kunnen verplaatsen, zat niet bij de gevonden structuren. ‘Er was maar een heel klein verschil in de structuur met en zonder calcium’, vertelt Paulino.

Voor deze observatie zijn verschillende verklaringen mogelijk: misschien transporteert dit eiwit de lipiden zonder dat er een holte ontstaat, of de experimentele omstandigheden waren niet optimaal voor het ontstaan van de ‘open’ toestand. Studies van het effect van verschillende mutaties op diverse plekken maken de eerste verklaring onwaarschijnlijk. Om verder te komen was er meer informatie nodig. ‘Dus gingen we terug naar het schimmeleiwit nhTMEM16.’

De experimenten met dit eiwit leverden succes op. Paulino en haar collega’s zagen een open toestand met een groeve die fosfolipiden kon transporteren. Daarnaast waren er een gesloten toestand en een tussenvorm waarin ionentransport mogelijk was. ‘Hier vonden we dus alle drie de toestanden, en allemaal in de aanwezigheid van calcium dat juist een open toestand zou moeten induceren. Onze resultaten suggereren dat de structuur zeer dynamisch is, waarbij de verschillende toestanden met elkaar in evenwicht zijn.’ De resultaten wijzen er ook op dat er naast calcium nog een factor betrokken is bij de regulatie van de activiteit van TMEM16 eiwitten. Dat past bij het idee dat de activiteit in cellen heel strikt is gereguleerd.

Niet zwart/wit

Inmiddels hebben Paulino en haar collega’s nu een veel duidelijker beeld van de werking van de TMEM16 eiwitten. ‘We weten dat die niet zwart/wit is, er bestaan verschillende vormen van het eiwit naast elkaar in een dynamisch evenwicht.’ In de volledig open toestand werken de eiwitten als scramblases, in de intermediaire toestand is alleen ionentransport mogelijk. Dit suggereert dat de eiwitten ontstaan zijn als scramblases, maar dat sommige familieleden evolueerden tot pure ionenkanalen, mogelijk door mutaties die het eiwit vooral in de intermediaire toestand lieten bestaan.

Om dit complexe werkingsmechanisme van de TMEM16 eiwitten te achterhalen was een enorme hoeveelheid structurele en functionele gegevens nodig. Voor Paulino laat dit opnieuw zien wat voor krachtig instrument cryo-EM is: ‘Hiermee konden we de dynamiek van de structuur in beeld brengen, doordat we het eiwit in verschillende toestanden zagen.’

References:

Carolina Alvadia, Novandy K Lim, Vanessa Clerico Mosina, Gert T Oostergetel, Raimund Dutzler, Cristina Paulino: Cryo-EM structures and functional characterization of the murine lipid scramblase TMEM16F. eLife 12 March 2019 DOI: 10.7554/eLife.44365

Valeria Kalienkova, Vanessa Clerico Mosina, Laura Bryner, Gert T Oostergetel, Raimund Dutzler, Cristina Paulino: Stepwise activation mechanism of the scramblase nhTMEM16 revealed by cryo-EM. eLife, 12 March 2019 DOI: 10.7554/eLife.44364