Meer licht onder de microscoop

Wetenschappers van de Rijksuniversiteit Groningen hebben een nieuwe, verbeterde manier ontwikkeld om fluorescerende labels te gebruiken bij microscopisch onderzoek. Door een beschermende ‘fotostabilisator’ te koppelen aan de fluorescerende verbinding (de fluorofoor) blijft deze veel langer licht uitzenden. De resultaten zijn op 11 januari gepubliceerd in het tijdschrift Nature Communications.

Het is tegenwoordig een standaard techniek om kleine objecten, zoals cellen, virussen of zelfs losse moleculen zichtbaar te maken onder een microscoop: plak een molecuul dat licht kan uitzenden aan het object. Dat levert zeer gedetailleerde beelden op. De Nobelprijs voor Chemie werd in 2014 zelfs toegekend voor de ontwikkeling van hoge-resolutie fluorescentie microscopie, de techniek die de beste optische resolutie geeft.

‘Maar dat gaat niet zomaar’, legt Thorben Cordes uit. Hij is als adjunct-hoogleraar Moleculaire Microscopie verbonden aan het Zernike Institute for Advanced Materials van de RUG. ‘Bij alle microscopische technieken, vooral waar een hoog oplossend vermogen nodig is, gaan de fluorescerende labels snel in kwaliteit achteruit. Daardoor kun je een object maar een beperkte tijd observeren.’

Oplossing

Hoe komt het lichtsignaal eigenlijk tot stand, en waarom verdwijnt het? Wanneer je blauw licht laat schijnen op een fluorofoor zendt deze groen licht uit. De energie van de blauwe fotonen brengt het label in aangeslagen toestand, wat zorgt voor het uitzenden van groene fotonen. Die cyclus van aanslaan en uitzenden moet miljoenen keren herhaald worden om een bruikbaar microscopisch plaatje te krijgen. Maar tijdens die cycli ontstaat zo nu en dan een chemisch reactieve vorm van het fluorofoor. ‘Als dat het geval is stopt de emissie direct, en het fluorofoor is dan doorgaans permanent onbruikbaar.’

Om dit te voorkomen kun je een zogeheten fotostabilisator toevoegen die tijdens het experiment de fluorofoor beschermt tegen chemische afbraak. ‘Maar die fotostabilisatoren zijn doorgaans giftig, en je moet ze ook nog in hoge concentraties gebruiken willen ze effect hebben.’ Dat levert praktische problemen op, je kunt fotostabilisatoren bijvoorbeeld niet gebruiken bij onderzoek naar levende cellen of organismen.

Cordes heeft daarom een subtieler oplossing bedacht, die overigens al eens is getest in de jaren 1980. ‘De fotostabilisator werd direct gekoppeld aan de fluorofoor. Doordat ze aan elkaar zitten heb je er veel minder van nodig’, legt hij uit. Dit werkt prima, maar het koppelen van een fotostabilisator aan een fluorofoor en daarna aan het object dat je wilt onderzoeken (zoals een cel) bleek zeer lastig te zijn. Bovendien was de techniek destijds maar voor één type fluorofoor ontwikkeld. De methode raakte al snel in onbruik.

‘Ik wilde dit concept daarom meer algemeen toepasbaar maken, zodat het de nieuwe standaard zou kunnen worden in fotostabilisatie. En gelukkig was Jasper van der Velde, een promovendus uit mijn groep, enthousiast over dit idee’, zegt Cordes.

Met hulp van collega’s uit Groningen, Oxford en Göttingen wist de groep van Cordes een min of meer universeel systeem te ontwikkelen, dat ook nog eenvoudig te gebruiken is. ‘We namen een kunstmatig aminozuur als centrale spil, waaraan we dan de fotostabiliator, de fluorofoor en het te onderzoeken object kunnen koppelen.’ De drie verschillende verbindingen zijn met eenvoudige chemische reacties te koppelen aan het aminozuur. Dit gebeurt met reagentia die eenvoudig en goedkoop zijn te verkrijgen.

Cordes: ‘Om de juiste synthetische routes te ontwikkelen hadden we natuurlijk hulp nodig van experts. Gelukkig zijn we geholpen door synthetisch chemici Gerard Roelfes en Andreas Herrmann, beiden RUG-collega’s. Zonder hun inspanningen zou dit niet zijn gelukt. Maar nu hebben we een methode waarmee we in principe de werking van alle typen fluoroforen kunnen verbeteren.’ Hij laat in een kort filmpje zien hoe gestabiliseerde fluoroforen veel langer meegaan dan de niet-gestabiliseerde versie.

In de toekomst zullen onderzoekers hun eigen gestabiliseerde fluoroforen kunnen maken, met behulp van commercieel verkrijgbare chemicaliën. Maar Cordes kijkt inmiddels ook of het mogelijk is de gestabiliseerde fluoroforen commercieel te laten produceren. ‘De afgelopen twee jaar hebben we al verschillende verzoeken gekregen van collega’s die de nieuw fluoroforen wilden uitproberen. Op de monsters die we hen toezonden kregen we hele positieve reacties.’

Een zo’n collega viel in het bijzonder op: ‘Ik ben er best trots op dat Stefan Hell, een van de drie winnaars van de Nobelprijs Chemie in 2014 voor hoge resolutie fluorescentie microscopie, ons project heeft besproken en heeft gesteund. Hij heeft fluoroforen beschikbaar gesteld en toegang tot hoog-resolutie microscopen geregeld. Daarmee konden we de prestaties van onze fluoroforen testen voor het maken van hoog-resolutie opnamen.’

Referentie: van der Velde, J. H. M. et al. A simple and versatile design concept for fluorophore derivatives with intramolecular photostabilization. Nature Communications 7:10144 (2016) . doi: 10.1038/ncomms10144

Terug naar het Science LinX nieuwsoverzicht