Nieuw inzicht in ontstaan antibioticumresistentie

We weten al veel over het ontstaan van resistentie tegen antibiotica, maar nog niet over hoe dat in individuele cellen gebeurt. Bijna al het onderzoek naar resistentie vindt namelijk plaats met grote aantallen cellen tegelijk, in kweekflessen of op kweekplaten. Wat ontbreekt, zeggen RUG microbiologen Robin Sorg en Jan-Willem Veening, is een gedetailleerd onderzoek bij afzonderlijke cellen. Zij publiceerden zo’n onderzoek naar de voorwaarden voor het ontstaan van antibioticumresistentie in de ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae vandaag (30 oktober) in het tijdschrift Nature Communications.

Het grote plaatje is wel helder: wanneer je miljoenen bacteriën blootstelt aan een lage dosis van een antibioticum zullen een paar cellen dat overleven. En die kunnen uiteindelijk resistent worden en weer gaan delen. Een helder plaatje, maar niet erg gedetailleerd.

‘Dit soort onderzoek gebeurt meestal in celkweken, waar de groei van bacteriën is gemeten door te kijken hoe troebel het kweekmedium is’, legt Robin Sorg uit. ‘Maar dat levert maar heel weinig informatie op over hoe de resistentie zich precies ontwikkelt en hoe een bacterie in staat is om sneller te groeien dan de concurrentie. Antibioticaresistentie kost een bacterie iets, dus dat ontstaat alleen wanneer er een voordeel is voor resistente cellen.’ Daarom heeft hij, samen met zijn begeleider Jan-Willem Veening, het effect van antibiotica onderzocht bij bacteriën die onder een microscoop groeien. Dat levert belangrijke nieuwe inzichten op over het ontstaan van resistentie.

Sleutel

Sorg, die in de loop van volgend jaar zijn proefschrift zal verdedigen, richtte zich op de ziekteverwekkende bacterie Streptococcus pneumonia (de ‘pneumokok’). Hij keek toe hoe losse cellen groeiden in de aanwezigheid van verschillende antibiotica. ‘Er zijn wel wat single-cell studies gedaan naar het effect van antibiotica, maar geen daarvan onderzocht op systematische wijze de groeikinetiek, de metabolische activiteit en de variabiliteit tussen cellen. Terwijl juist deze factoren misschien wel de sleutel vormen waarmee we het ontstaan van resistentie kunnen begrijpen’, vertelt Sorg.

Ieder experiment startte met een paar losse cellen in een speciale kweekkamer die op een microscoop was gemonteerd. Dat leverde filmpjes op van groeiende – of niet groeiende – bacteriën. Sorg gebruikte verschillende concentraties van antibiotica die bacteriedodend of groeiremmend zijn en mat de kinetiek van de groei. Daarnaast gebruikte hij speciale merkerstoffen om gen-expressie in de cellen te meten, wat laat zien hoe gezond en actief de bacteriën zijn.

Cellen die werden blootgesteld aan een bacteriostatisch (groeiremmend) antibioticum lieten direct een reactie zien, naar mate de concentratie hoger was groeiden ze trager. ‘Maar ook de vorm van de cellen veranderde, ze zagen er ongezond uit.’ Na een aantal uren stopten ze helemaal met groeien. ‘We zagen een opvallend verschil in de gevoeligheid voor deze antibiotica tussen genetisch identieke cellen’, legt Sorg uit. ‘Dat wijst erop dat epigenetische factoren een rol spelen bij de selectie van cellen die resistentie ontwikkelen.’

Stofwisseling

Hij deed dezelfde experimenten ook met bacteriedodende antibiotica. ‘Die bacteriën groeiden in eerst instantie normaal door, hoe hoog de concentratie ook was. Maar dan stopten ze plotseling en gingen dood. De celschade die dit soort antibiotica veroorzaakt heeft blijkbaar in eerste instantie geen effect op de groei en bovendien zagen we dat die schade ontstaat door de stofwisseling in de cel.’ Opvallend genoeg bleven deze cellen er gewoon uit zien.

In alle experimenten bleken cellen die niet meer groeiden toch actief te kunnen zijn, met een meetbare stofwisseling en gen-expressie. ‘Dat is belangrijk voor de ontwikkeling van resistentie’, vertel Sorg. Uit zijn gegevens blijkt dat in de meeste gevallen de cellen die overleven dat in eerste instantie doen via niet-genetische mechanismen. Mutaties die resistentie veroorzaken treden pas later in het proces op. ‘De cellen hebben tijd nodig om die mutaties te krijgen. En daarvoor moeten ze kunnen overleven in de aanwezigheid van antibiotica.’ De tijd tussen het toedienen van het antibioticum, de impact op de groei en de uiteindelijke celdood wordt dan ook het ‘mutanten selectie venster’ genoemd. Dat venster is cruciaal om het ontstaan van resistentie te begrijpen.

Als cellen er lang over doen om dood te gaan is er meer tijd waarin genetische resistentie kan ontstaan. En sommige antibiotica stimuleren zelfs het ontstaan van mutaties.’ Maar wanneer de stofwisseling vertraagt, neemt de kans dat een cel nieuwe mutaties krijgt af. Dat is belangrijke informatie voor de ontwikkeling van antibiotica, zegt Sorg: ‘Middelen die de cel-activiteit snel platleggen verkleinen de kans op het ontstaan van resistentie.’

Ook de dosis van het geneesmiddel is belangrijk. Nadat een patiënt een antibioticum heeft ingenomen zal je verschillende concentraties krijgen in verschillende weefsels. ‘Om de ontwikkeling van resistentie te minimaliseren is het vermoedelijk beter om een hogere dosis te gebruiken dan strikt noodzakelijk is om de patiënt te genezen. Maar dat vergroot de kans op bijwerkingen. Het belang van de individuele patiënt moet je dan ondergeschikt maken aan het belang van toekomstige patiënten die antibiotica nodig hebben waarvoor bacteriën nog niet resistent zijn.’

Referentie: Robin A. Sorg and Jan-Willem Veening, Micro-scale insights into pneumococcal antibiotic mutant selection windows, Nature Communications 30 oktober, DOI 10.1038/NCOMMS9773