Discovery and biocatalytic exploration of fungal ene-reductases

Ontdekking en biokatalytische exploratie van fungale ene-reductasen

Biokatalyse maakt gebruik van het katalytische vermogen van de natuur om chemische reacties te vergemakkelijken. Enzymen, als voorbeelden van deze functie, spelen een cruciale rol bij het bemiddelen van verschillende chemische transformaties, meestal onder milde omstandigheden en met uitzonderlijke selectiviteit. Deze eigenschappen maken enzymen zeer aantrekkelijk voor industriële chemische processen, die meer efficiënte en milieuvriendelijke syntheseroutes bevorderen die hulpbronnen behouden en afval minimaliseren. Een illustratieve toepassing van biokatalyse omvat de productie van enantiopure verbindingen, bereikt door het gebruik van ene-reductasen die verantwoordelijk zijn voor het reduceren van dubbele bindingen naast elektron-onttrekkende groepen. Deze enzymen hebben aanzienlijke aandacht gekregen, met studies gericht op het verkennen van nieuwe methodologieën en het onderzoeken van nieuwe enzymen die hogere omzettingsgetallen, verbeterde thermische stabiliteit of andere biokatalytische relevante eigenschappen vertonen. Dit proefschrift van Pedro Damada is een zoektocht naar het identificeren en verkennen van nieuwe ene-reductasen.

Promovendus Damada: ‘Oude gele enzymen (OYEs) katalyseren de reductie van de dubbele binding in α,β-onverzadigde verbindingen, vooral die met een elektronenzuigende groep. Dit is van belang voor synthetische chemietoepassingen die gericht zijn op de synthese van enantiomeerzuivere verbindingen. OYEs overtreffen chemische katalysatoren door hun hoge enantioselectiviteit/stereoselectiviteit en werkzaamheid onder milde omstandigheden. Het eerste OYE werd in 1932 beschreven, vandaar de naam.

Sindsdien zijn veel andere OYE-type reductasen ontdekt, maar talloze ene-reductasen blijven nog onontdekt in diverse bronnen. Recente classificatie verdeelt deze enzymen in zeven klassen op basis van sequentie- en structurele kenmerken. Deze studie richtte zich op OYEs uit schimmels, met name Penicillium citrinum CBMAI 1186 en Penicillium steckii (beide mesofiele soorten), samen met Aspergillus thermomutatus, Chaetomium thermophilum, Lachancea thermotolerans, Ogatae polymorpha en Thermothielavioides terrestris (alle mesothermofiele soorten). Het onderzoek met P. citrinum CBMAI 1186 betrof hele-celreacties om α,β,γ,δ-onverzadigde verbindingen te reduceren. Voor P. steckii werden elf OYE-coderende genen geselecteerd, wat resulteerde in zes tot expressie gebrachte en gezuiverde enzymen.

De karakterisering van deze enzymen omvatte reactiesnelheden, thermische stabiliteit, pH-optimum en substraatacceptatie. Om de toolbox van OYEs met robuuste varianten uit te breiden, werden vijf genen van thermofiele schimmels geselecteerd voor een verkennende biokatalytische studie, wat resulteerde in de productie en karakterisering van vijf thermostabiele OYEs. Vervolgens werden vier nieuw ontdekte OYEs geselecteerd voor het uitvoeren van hele-celconversies met Escherichia coli. Met een tweefasensysteem konden efficiënte conversies worden bereikt. Samengevat richtte dit werk zich op de acquisitie, het onderzoek en de toepassing van schimmel-OYEs, om bij te dragen aan nieuwe inzichten die de bestaande kennis van deze enzymgroep aanvullen, terwijl de beschikbare toolbox van OYEs voor biokatalyse wordt verrijkt, waardoor de vooruitzichten voor toekomstige toepassingen worden uitgebreid.’

Proefschrift: https://hdl.handle.net/11370/5caa8963-8846-442a-affe-e57fbef483ff