A novel FRET-based method for monitoring protein phase separation in living cells

FRET-gebaseerde methode om eiwitcondensatie en –aggregatie te onderzoeken

Eiwitfasescheiding (biomoleculaire condensatie) heeft de potentie een universeel fenomeen te zijn bij verschillende cellulaire processen. Eiwitaggregatie als gevolg van biomoleculaire condensatie is een therapeutisch doelwit ter voorkoming van verscheidene ziekten, met name neurodegeneratieve ziekten.

Qi Wan presenteert in haar proefschrift we de ontwikkeling van een op FRET gebaseerde (Förster/Fluorescent Resonance Energy Transfer gebaseerd) methode voor continue en high-throughput monitoring van zelfassemblages van eiwitten, zodat we transiënte toestanden kunnen identificeren. Intermoleculaire FRET met zowel het donor- als het acceptoreiwit op hetzelfde te onderzoeken eiwit, biedt een hoge gevoeligheid terwijl het voordeel van eenvoudige ratiometrische metingen behouden blijft. Deze methode passen we toe om de zelfassemblage van drie eiwitten te monitoren. We laten zien dat de mHttex1 eerst minder geordende assemblages vormt, die zich ontwikkelen tot fibrilachtige aggregaten. We demonstreren dat het chaperonne-eiwit DNAJB6b de kritische verzadigingsconcentratie van mHttex1 verhoogt op een concentratie- en temperatuurafhankelijke manier. Ook monitoren we de structurele veranderingen in FUS-condensaten en onderzoeken we de invloed van osmotische stress. Deze nieuwe, op FRET gebaseerde methode draagt bij aan de gereedschapskist voor het bepalen van de zelfassemblagestructuur van eiwitten en het bepalen van de kinetiek, en implementatie met natieve of niet-natieve eiwitten kan van grote nut zijn voor studies met betrekking tot eiwitcondensatie of aggregatie.

Proefschrift: https://hdl.handle.net/11370/f9dbeec4-dc53-4f53-897c-0f0d3e4c6b65